活细胞中的脂质分辨：高光谱中红外光声显微镜的新突破

脂质不仅是细胞膜的结构成分和能量储存分子，更与癌症、肥胖、糖尿病、心血管疾病及神经退行性疾病的发生发展密切相关。然而，在活细胞中直接观察和区分不同种类的脂质，长期以来面临着技术挑战。传统的荧光标记方法受限于标记效率、特异性和对细胞功能的潜在干扰，而无标记的光学技术往往难以区分化学结构相似的脂质分子。

《自然-方法》（Nature Methods）发表了一项研究，介绍了一种名为“高光谱指纹区光声显微镜”（hyFOPM）的技术。该技术利用中红外指纹区的单键振动模式，实现了在活细胞中对鞘磷脂（SM）和胆固醇（Chol）的标记free检测与动态成像。

技术原理

多数无标记光学方法依赖C-H伸缩振动区域（约2800-3000 cm⁻¹）的信号，但这一区域的谱带在多种脂质中高度相似，难以区分不同种类。与之相比，中红外指纹区（900-1730 cm⁻¹）包含了更多反映分子独特结构的单键振动信息，如酰胺键、酯键和甾环的特征吸收。

hyFOPM系统的设计围绕这一思路展开。它采用可调谐量子级联激光器作为激发光源，覆盖900-2932 cm⁻¹范围，光谱分辨率达到2 cm⁻¹。激光脉冲激发样品产生光声信号，由超声换能器检测，从而构建高光谱图像。该系统的空间分辨率约为4.3微米，能够在活细胞层面进行成像。

脂质模型的验证

为了验证技术的可行性，研究团队首先制备了含有胆固醇（Chol）、不饱和磷脂酰胆碱（DOPC）和鞘磷脂（SM）的二维脂质溶液模型。

l光谱特征对比

 hyFOPM采集的指纹区光谱与ATRFTIR结果高度吻合。三种脂质表现出可区分的谱峰：胆固醇在1056 cm⁻¹处呈现甾环变形的强吸收峰；DOPC在1731 cm⁻¹处具有酯基C=O伸缩振动；鞘磷脂则在1645 cm⁻¹、1555 cm⁻¹和1464 cm⁻¹处分别对应酰胺I带、酰胺II带及脂肪酸CH₂弯曲振动。

l光谱解混与分类能力

 仅使用指纹区的15个波数进行线性解混时，胆固醇与鞘磷脂的串扰接近0%，DOPC的串扰为23%。而使用C-H伸缩区的7个波数时，串扰明显升高。进一步采用线性判别分析（LDA），分类平均准确率在使用指纹区或C-H区时均达到96%，使用全部波数时达到97%。

l巨型单层囊泡（GUV）模型

研究制备了三种GUV以模拟细胞膜：模型1为SM与Chol 1:1混合物，形成致密有序膜；模型2为DOPC、SM和Chol按2:2:1混合，同时存在液有序与液无序相；模型3仅为DOPC，形成无序流体膜。hyFOPM在2852 cm⁻¹处获取的图像与尼罗红荧光染色的结果在形态上一致。不同囊泡的光谱特征与纯脂质对应，证实混合膜中各组分可被识别。

l质量控制应用

通过对每种类型10个不同GUV进行光谱测量并绘制三元相图，研究团队发现实际脂质组成与目标配比存在偏差（最大差异约40%）。这表明hyFOPM可用于GUV制备的质量评估。

活细胞中的应用

研究进一步将hyFOPM应用于活细胞，分别在两种细胞模型中观察了鞘磷脂和胆固醇的动态变化。

lA549细胞中鞘磷脂的累积

使用抗肿瘤化合物2-羟基油酸（2-OHOA）处理人肺腺癌细胞（A549），预期会诱导鞘磷脂的累积。在50个细胞上采集指纹区光谱（1600-1400 cm⁻¹），结果显示处理后1464 cm⁻¹峰面积增加了117%，而对照组同期仅增加23%。随后对3000个细胞仅使用四个波数（2852 cm⁻¹总脂质、1540 cm⁻¹蛋白酰胺II、1464 cm⁻¹鞘磷脂、1048 cm⁻¹胆固醇）进行成像，结果表明鞘磷脂信号在处理后48小时和72小时持续上升，胆固醇信号没有明显变化。

lHEK细胞中胆固醇的负载

将人胚胎肾细胞（HEK293）与甲基-β-环糊精-胆固醇复合物（MβCD-Chol）共孵育，以增加细胞膜中的胆固醇。50个细胞的指纹区光谱显示，处理后1048 cm⁻¹峰面积增加了161%，而鞘磷脂的1464 cm⁻¹峰略有下降——这与环糊精在递送胆固醇的同时也会提取部分膜脂质的已知特性相符。对3000个细胞的多波数成像进一步确认了胆固醇信号的升高，总脂质信号略有上升，蛋白信号变化不大。

意义与展望

该研究展示了在活细胞中无标记区分化学结构相似脂质分子的能力。与依赖荧光或同位素标记的传统方法相比，hyFOPM避免了标记效率和细胞功能干扰等问题，其选择性可通过调整激发波数灵活适配目标脂质的谱特征。

当前系统在指纹区的光谱特异性优于C-H伸缩区，这为区分更多脂质亚型提供了可能。研究也指出，结合深度学习等先进光谱解混技术，有望进一步提升灵敏度和特异性。此外，中红外光声显微技术在组织中可达150微米以上的成像深度，未来可向厚样本或活体应用拓展。技术加速（如光谱欠采样）和系统小型化将是推动该技术走向床旁分析或实验室常规检测的重要方向。